蝙蝠全身骨質輕，頭骨愈合程度較高，肩帶發達，胸骨具龍骨狀突起。後肢胫骨、腓骨退化。耳殼發達，常具發達的耳屏或對耳屏。翼膜、耳、唇等處有豐富的感覺毛。顔色多樣，大多是褐色、灰色和黑色。
蝙蝠前肢特化，尤其是骨骼有較大的變化。肱骨顯著短于桡骨（前臂骨），尺骨退化；除第一指不特别延長，末端有爪，其餘掌骨和指骨均特别延長，各掌、指骨間生有皮膜，向後一直與後肢和尾部相連。連接各指間的皮膜稱翼膜，前肢肱骨和後肢間皮膜稱側膜，前肢肱骨和前臂骨前的皮膜稱前翼膜，連接左右後肢和尾部的稱股間膜。股間膜其膜緣常有距，起支撐股間膜作用，距外側皮膜稱之為距緣膜。後肢短小，大腿部與身體呈直角且位于同一平面。側膜常止于胫下部、踵部或趾基部。後肢足部完全位于皮膜以外，五趾均具爪，用于鈎挂。
蝙蝠牙齒齒冠原始，原始齒型相比，缺第一對門齒和第一對前白齒。門齒弱，犬齒發達，基部常有粗壯的基嵴。前臼齒有分化，最後一枚前臼齒顯著的大，其齒尖可達犬齒齒尖的高度，臼齒齒冠呈“W”形。
蝙蝠雄性具有顯著的陰莖，但一般無陰囊，睾丸留于腹腔内或會陰部。雌性具雙分子宮或雙子宮，繁殖時形成盤狀胎盤。胸部有一對乳頭。耳殼發達，常具發達的耳屏或對耳屏。翼膜、耳、唇等處有豐富的感覺毛。
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