皮膚為人體提供物理屏障和免疫保護，這些功能由不同的功能層、細胞類型和細胞外基質來完成。盡管它在人類健康和疾病中發揮着核心作用，但皮膚的蛋白質組成還沒有被系統地研究過。

為探讨這個問題，蛋白質組學領域大牛Matthias Mann的研究團隊結合先進的組織解剖方法，流式細胞術和先進的DIA蛋白質組學策略，對人類皮膚進行了空間分辨定量的蛋白質組圖譜描繪，成功地獲得了包含10701個蛋白質的蛋白質組圖譜，這是迄今為止從人類皮膚獲得的最大的蛋白質組數據集。該成果于2020年11月5日發表于國際權威期刊《Nature Communications》。

實驗材料

人類健康皮膚組織、免疫細胞，約60 樣本

技術路線

研究結果

1. 人類皮膚的深入定量蛋白質組學圖譜

首先，研究人員利用不同的方法分别獲得了内外表皮、真皮和皮下組織、角質形成細胞和成纖維細胞的原代培養細胞、免疫細胞、黑素細胞和内皮細胞。這些樣本構成了皮膚組織的完整深度及其主要細胞類型。

為了建立一個深度皮膚蛋白庫，研究人員采用了分級策略，并使用DDA數據采集模式進行分析，共鑒定到了10701個蛋白質。這對于皮膚組織的蛋白組而言，達到了一個前所未有的覆蓋深度。這個數據庫在全蛋白質組水平為研究皮膚功能和組成提供了良好的基礎。随後，他們利用DIA數據采集模式進行了定量蛋白組分析。

結果顯示，大多數蛋白質(6025; 56.3%)在四層均有表達，隻有少數蛋白(569;5.3%)隻在某一層中表達。這些發現與之前對其他組織的研究一緻，表明大多數表達的蛋白在多種組織類型均存在，但不同組織之間同一蛋白質豐度差異很大。

2. 皮膚蛋白質組的空間梯度

為了讨論不同分層皮膚組織的功能特征，研究人員利用DDA數據及進行了深入分析。首先，他們分析了表皮中的47種皮膚角蛋白(KRTs)、使外層肌膚具有機械穩定性的谷氨酰胺轉胺酶以及真皮中提供結構支架和彈性的相關糖蛋白，蛋白組學數據證實了這些蛋白質在皮膚中處于執行這些功能的良好位置。

除了結構上的作用外，皮膚同時扮演着主動和被動的免疫屏障的角色。因此，接下來研究人員分析了具有免疫功能的蛋白質的空間梯度。其中S100家族蛋白成員具有非常明顯的空間分布。

此外，蛋白組學數據還表明，皮膚存在廣泛的免疫活性蛋白庫，包括趨化因子（CXCL12/14）、抗菌肽（防禦素β1/β2）、基質金屬蛋白酶（MMP2/3/9）和細胞因子等。綜上所述，這些分析對人體皮膚中不同的結構和細胞類型中的免疫活性蛋白進行了細緻的定量蛋白質組學比較。

3. 培養成纖維細胞和角化細胞的蛋白質組圖譜

接下來的分析中，研究人員進一步關注了皮膚中的組成細胞類型，并選擇DIA策略對不同細胞類型的蛋白組進行比較。

此前有報道稱，内皮唾酸蛋白（CD248/TEM1）是皮膚成纖維細胞内表達的蛋白。蛋白組結果顯示，内皮唾酸蛋白位于成纖維細胞蛋白質組的前三分之一，其他類型的細胞中幾乎沒有檢測到。因此，研究人員使用内皮唾酸蛋白的豐度曲線作為參照，以确定具有相似豐度模式的TOP100蛋白質。

與角質形成細胞相關性最好的TOP100蛋白質包括：細胞間黏附蛋白（cornifelin plakophilin 3、TNS4 DSG3, LAD1）,上皮細胞轉化和分化相關蛋白（FAM83B ZNF185）和KLK5，以及角質細胞特異性血管舒緩素。此外，還發現了一些在角質形成中沒有功能特征的蛋白。

值得注意的是，在單層培養細胞中，許多角質形成細胞過程已知的重要功能蛋白并沒有被鑒定出來。由于這些蛋白在相關的皮膚層較易被識别，這些差異可能證明了培養的角質形成細胞與體内角質形成細胞之間的生物學差異。

4. 細胞亞群蛋白質組分析探索新蛋白

由于樣品量的限制，人類皮膚細胞亞群的蛋白質組學深度分析一直存在技術瓶頸。在這項研究中，研究人員制備了從健康人的皮膚新鮮分離的單細胞懸液，并制備了34個樣品進行DIA蛋白質組學分析。分析中使用了包含内皮細胞、黑素細胞、樹突細胞、肥大細胞、巨噬細胞和PBMCs在内的細胞亞群的深層蛋白質組作為DIA的比對數據庫。

PCA分析直觀呈現了包括培養的亞群在内的各個細胞亞群之間的共性和差異。層次聚類分析顯示，不同細胞類型呈現帶有明顯不同蛋白簇分布。這些蛋白簇中，研究人員發現了39個激酶和16個泛素蛋白連接酶，它們在皮膚中的功能尚未确定。接下來，研究人員對各個細胞類型的蛋白表達譜進行了分析。從層次聚類和表達譜分析中獲得的這些特征蛋白集，可能存在與這些皮膚細胞類型相關的功能蛋白質。綜上所述，上述研究整合揭示了大量在皮膚中功能尚未定義的的蛋白質，為進一步的探索提供了良好的基礎。